一、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的原理

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

用途：藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗(yàn)
 

CCK8的優(yōu)點(diǎn)：

• 使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；
• CCK-8法能快速檢測；
• CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；
• CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法；
• CCK-8法對細(xì)胞毒性??；
• CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。

CCK8的缺點(diǎn)：

• 與MTT法相 比，CCK8和XTT的價(jià)格比較貴。
• CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。

與以往的增殖/毒性測定試劑相比較：
 

二、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的方法
實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞增殖分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做3個(gè)重復(fù)。

3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。
5、培養(yǎng)1-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)*條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。
 

實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞毒性分析
1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做3個(gè)重復(fù)。

3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)

5、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時(shí)間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來決定，起碼要一代以上的時(shí)間。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。
7、培養(yǎng)1-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)*條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

注：

• 若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。
• 如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

三、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的注意事項(xiàng)

• 當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的zui小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。
• 酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
• CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測定的過程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。
• CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。
• 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板zui外一圈的孔zui容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，zui外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。
• 在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。
• 金屬對CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。
• 懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間。